納米抗體介導PROTACs蛋白靶向降解技術

想要了解一個基因的功能,通常的做法是在DNA或mRNA水平抑制基因的表達,然后觀察表型的變化,而表型的變化通常是由蛋白的缺失導致的。但是,這些方法沒有直接作用于蛋白,只是暫停了蛋白質的轉錄或翻譯,蛋白的缺失還是依賴于其自身的半衰期。因此,這些方法不能有效敲減半衰期長的蛋白或溶解度低的蛋白聚集體。在DNA或mRNA水平抑制蛋白的表達,通常需要較長的時間(>48 h),不能用于研究蛋白水平快速變化的生命過程,如細胞周期。正是因為時間的延遲,細胞有足夠的時間啟動其他補償機制,彌補單個蛋白水平的下降,有可能掩蓋了表型的變化。

為了可以直接降解目標蛋白,人們已經開發出了許多方法。Proteolysis targeting chimeras  (PROTACs) 就是其中之一,它利用細胞本身的泛素-蛋白酶體系統來降解胞內蛋白。這項技術的局限之處在于,我們需要為目標蛋白找到高親和力的小分子配體,這對于一些“不可被靶向”的蛋白來說往往是非常困難的。其他技術包括auxin inducible degron system【1, 2】、Trim-Away【3】和改造的納米抗體【4, 5】等,這些方法需要對細胞內源蛋白進行改造,或需要特定外源蛋白的表達,各有優劣。

近日,University of Dundee的Ronald Hay課題組在Molecular Cell 上發表了題為Antibody RING-Mediated Destruction of Endogenous Proteins 的論文,報道了他們開發的Antibody RING-mediated destruction (ARMeD) 系統。研究者把E3泛素連接酶和駱駝納米抗體組裝在一起,引入細胞后可在數分鐘內介導內源靶蛋白的降解,且沒有檢測到脫靶效應的存在。

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E3泛素連接酶RNF4的C端為RING(Really Interesting New Gene)結構域,負責招募裝載了泛素的E2。實驗者把RING和特異性識別黃色熒光蛋白(YFP)的納米抗體融合,成功在HeLa細胞引發了YFP-PARG(poly ADP ribose glycohydrolase) 融合蛋白的泛素化和依賴蛋白酶體的降解,初步證明了ARMeD系統的可行性。

接下來,作者要把ARMeD系統真正應用于細胞內源蛋白的降解。實驗人員選定了一個靶點:NEDP1蛋白,并生產了一系列靶向NEDP1的駱駝納米抗體。類似地,納米抗體-RING融合蛋白成功促進了NEDP1的降解。更重要的是,研究人員通過蛋白質組學的方法,檢測不到脫靶效應的存在,說明納米抗體的專一性保證了ARMeD系統的高度特異性。

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基因敲除或RNA干擾的方法并不適用于研究半衰期長的蛋白,如核孔復合體和神經退行性疾病相關的蛋白聚集體。這項研究中提出的單一組分ARMeD技術有效解決了這個難題??梢灶A見的是,隨著越來越多的納米抗體被開發出來,以及胞內遞送技術的不斷優化,ARMeD技術在基礎研究和臨床應用方面的優越性將逐漸顯現。


參考文獻:

1. Holland, A.J., Fachinetti, D., Han, J.S., and Cleveland, D.W. (2012). Inducible, reversible system for the rapid and complete degradation of proteins in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, E3350–E3357.

2. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., and Kanemaki, M. (2009). An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat. Methods 6, 917–922.

3. Clift, D., McEwan, W.A., Labzin, L.I., Konieczny, V., Mogessie, B., James, L.C., and Schuh, M. (2017). A Method for the Acute and Rapid Degradation of Endogenous Proteins. Cell 171, 1692–1706.e18.

4. Caussinus, E., Kanca, O., and Affolter, M. (2011). Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 117–121.

5. Fulcher, L.J., Macartney, T., Bozatzi, P., Hornberger, A., Rojas-Fernandez, A., and Sapkota, G.P. (2016). An affinity-directed protein missile system for targeted proteolysis. Open Biol. 6, 160255.

本文來自BioArtReports,原文鏈接:https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.04.032



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